酶免疫分析的技術(shù)進步

  近年來，EIA技術(shù)取得了顯著的發(fā)展，主要表現(xiàn)在以下方面：

1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用，明顯地提高了檢測的特異性，基本消除了抗原、抗體間的非特異性交叉反應(yīng)，保證了分析的準確性。抗體制備技術(shù)的進步，使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)?；?，檢測范圍日益擴展，小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。

2、分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。

（1）除早期的競爭法，間接法外，又發(fā)展了雙抗原夾心法測抗體，偶聯(lián)酶標記法測抗原，橋聯(lián)酶免疫分析，酶放大免疫分析技術(shù)等，后者應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng)，底物循環(huán)放大系統(tǒng)，酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。

（2）由于酶標記技術(shù)的進步，標記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶，擴展到堿性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脫氫酶，葡萄糖氧化酶，蘋果酸脫氫酶，至今有二十多種酶被應(yīng)用于EIA ，但應(yīng)用最多的仍然是辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。

（3）酶免疫分析與其它標記免疫分析相結(jié)合如與熒光免疫分析（Fluorescence Immunoassay ,FIA）結(jié)合形成熒光酶免疫分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay ，F(xiàn)EIA），酶促放大時間分辨熒光免疫分析（Enzyme-am-plified time-resolved fluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA與化學發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）結(jié)合形成酶—化學發(fā)光免疫分析，增強化學發(fā)光酶免疫分析（ECLEIA）。EIA與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合形成的PCR-EIA分析等。

（4）改進固相載體的技術(shù)

傳統(tǒng)ELISA應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板，聚苯乙烯珠或條，后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量，增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面，如用化學偶聯(lián)法導入功能性醛基、酰基、烷胺基等以更好地與蛋白質(zhì)，多肽的羧基結(jié)合，用位點導向性共價偶聯(lián)法引入親和素，蛋白A，多聚賴氨酸等，以牢固地捕獲蛋白或多肽，超平整聚苯乙烯表面的制備，克服了表面粗糙帶來的不均一性，達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面，實現(xiàn)了對蛋白的結(jié)合容量大，脫附率低，孔間均一性好，使試驗精密度達5%。

應(yīng)用于雙抗體夾心法時，聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，可以增加其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標板，其質(zhì)量達到氨基活化相似水平。

（5）分析方法的創(chuàng)新 如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上，蓋上釘板的同時與微孔內(nèi)的所需標本、試劑反應(yīng)，是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復合物的特性，將常規(guī)二步溫育法改為一步溫育測定法，使檢測時間大為縮短，現(xiàn)在已廣為應(yīng)用。