肝臟細胞RNA的提取原理

　　一．原理
　　
　　RNA提取技術不僅是分子生物學技術的重要組成部分，也是功能基因組學科研技術的重要基礎。從RNA水平研究生物體內基因的調控機制，已成為分子生物學研究的一個重要手段。對某一生物或組織進行性狀研究，首先要獲得該性狀基因，從組織細胞中分離完整的RNA對于分子克隆和基因表達分析等實驗是至關重要的，如Northern印跡及雜交分析、cDNA合成等實驗的成效在很大程度上取決于RNA的質量。利用提取的RNA人們可以對特定的基因表達進行定量的檢測，從分子水平的了解細胞生命活動的規律。通常一個典型的哺乳動物細胞約含有10-5μgRNA，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18S和5.8S、5S四種類型）；10%～15%為tRNA和核內小分子RNA。
　　
　　這些高峰度的RNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量1%～5%的為mRNA。mRNA雖然大小和核苷酸序列各不相同，從數百至數千堿基不等，但大多數真核細胞mRNA在其3''端均有一寡聚腺苷酸（polyA）組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo（dT）]，使得mRNA可以利用親和層析法分離。這個群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩定，易于降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩定，故在提取RNA時關鍵因素是zui大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內源RNA酶的活力，因此，創造一個無RNA酶的環境，嚴格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關鍵。
　　
　　對內源性RNA酶，主要運用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有：
　　
　　①RNA酶的蛋白質抑制劑（RNasin），它是從人胎盤分離的一種蛋白質，可以與多種RNA酶緊密結合形成非共價結合的復合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質抑制劑制品經數次凍融后或放在氧化條件下應棄之不用。RNA酶的蛋白質抑制劑不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯；
　　
　　②氧釩核糖核苷復合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是一種過渡態似物，它能與多種RNA酶結合并抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復合物能強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
　　
　　③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續的RNA純化過程中經離心除去；
　　
　　④異硫氰酸胍，它是強力的蛋白質變性劑，在破壞細胞結構使核酸從細胞核中解離出來的同時也使RNA酶變性失活；
　　
　　⑤焦碳酸二乙酯（DEPC），它是RNA酶強烈抑制劑，但其作用并不是的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理；
　　
　　⑥其它化學試劑，如SDS、尿素等對RNA酶也有一定的抑制作用。
　　
　　對外源性RNA酶主要通過以下幾個途徑污染RNA制品：
　　
　　①玻璃制品、塑料制品和電泳槽；
　　
　　②研究人員造成的污染；
　　
　　③污染的溶液。
　　
　　因此在實驗中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
　　
　　①實驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上（玻璃制品）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水*沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理；
　　
　　②在RNA提取過程中,應戴一次性手套,對接觸可能污染的器皿時，應勤換手套；
　　
　　③配制的溶液應盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。
　　
　　真核細胞總RNA制備方法有多種，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法、鹽酸胍—有機溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等。目前實驗室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細胞總RNA，是將已知zui強的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯合使用，抑制了RNA的降解，增強了核蛋白復合物的解離，使RNA和蛋白質分離并進入溶液，RNA選擇性地進入無DNA和蛋白質的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮。
　　
　　二．材料與方法
　　
　　1材料
　　
　　實驗魚，購于市場。
　　
　　2儀器、用具
　　
　　臺式離心機、恒溫水浴鍋（70℃）、分析天平、移液器、一次性注射器、方盤、鑷子、手術剪、培養皿、1.5ml離心管。
　　
　　3試劑
　　
　　95%的RNase-free乙醇；0.1%DEPC處理水；SVRNALysisBuffer；SVRNAdilutionBuffer；SVRNAWashSolution；YellowcoreBuffer；MnCl2；0.09M；DNaseⅠ；SVDNaseStopSolution；Nuclease-Freewater。
　　
　　4方法
　　
　　1）材料的準備
　　
　　（1）將培養皿、剪刀、眼科鑷滅菌，-20℃預冷。
　　
　　（2）用泡沫盒盛裝碎冰，將培養皿置于冰上，將剪刀、鑷子置于培養皿中。
　　
　　（3）用桶盛裝碎冰，加入少量的自來水，用紗布包裹魚放入桶中。
　　
　　（4）將已麻痹的魚置于方盤中，用剪于肛門向前及斜向上將腹腔剪開，取出內臟，分離肝臟置于培養皿中。
　　
　　（5）取1.5ml的離心管于分析天平上，調零。
　　
　　（6）用鑷子取20-30mg的肝臟組織于1.5ml的離心管中，稱重。
　　
　　2）實驗操作
　　
　　（1）取約30mg組織于1.5ml離心管中，加入175μlSVRNALysisBuffer，用一次性注射器將組織壓碎、反復抽打混勻。
　　
　　（2）加350μlSVRNADilutionBuffer（藍色），翻轉管子3-4次混勻，置70℃水浴3min。
　　
　　（3）冰上冷卻1-2秒，14000rpm離心10min，上清液移入一新離心管。
　　
　　（4）加入200μl95%的乙醇，槍頭混勻。
　　
　　（5）將上述混合液移入SpinBasketAssembly，14000rpm離心1min，棄濾液。
　　
　　（6）加入600μlSVRNAWashSolution（withethandadded），14000rpm離心1min，棄濾液。
　　
　　（7）在一新離心管中配制DNaseincubationmix：
　　
　　YellowCoreBuffer40μl
　　
　　MnCl20.09M5μl
　　
　　DNaseⅠ5μl
　　
　　（8）將上述50μl混合液直接加在SpinBasket的膜上，室溫（20-25℃）保育15min。
　　
　　（9）加200μlSVDNaseStopSolution（withethandadded）至SpinBasket14000rpm，離心1min。
　　
　　（10）加600μlSVRNAWashSolution，14000rpm離心1min，棄濾液。
　　
　　YellowcoreBuffer40μlMnCl2，0.09M5μlDNaseI5μl
　　
　　（11）加250μlSVRNAWashSolution，14000rpm離心2min，將SpinBasket轉移到一新離心管中。
　　
　　（12）加50μlNuclease-FreeWater至膜上，14000rpm離心1min，溶解RNA，-20℃保存。
　　
　　（13）取5μlRNA樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。
　　
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