考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定蛋白含量

 考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定蛋白含量 

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>掌握考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定蛋白含量的原理和方法。

2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置（λmax），由465 nm變?yōu)?/span>595 nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別色精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595 nm下測得的吸光度A595 nm,與蛋白質(zhì)濃度成正比。

試劑與材料：

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

稱取牛血清白蛋白（BSA）10mg，溶于100ml水，配置成100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

2. 考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑

100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 ml95％的乙醇后，再加入120 ml85％的磷酸，用水稀釋至1 L。

3. 材料：豆芽

操作步驟：

1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取試管6支按下表操作，搖勻，2～5 min后比色（595 nm），1管為空白對照管。作吸光度-蛋白濃度曲線。

2樣品蛋白濃度測定

準(zhǔn)確稱取豆芽1.0000g，加入用10mL研磨成勻漿后，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入小燒杯中。

準(zhǔn)確吸取樣品上清液1 ml置干凈試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250染料5 ml并搖勻，2～5 min后比色（595 nm）。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品蛋白濃度。

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