隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學發(fā)光轉(zhuǎn)到多重熒光。這一趨勢背后有多個推動力。zui重要的是，熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。熒光的其他好處在于動態(tài)范圍更寬、信號穩(wěn)定性更好。
隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學發(fā)光轉(zhuǎn)到多重熒光。這一趨勢背后有多個推動力。zui重要的是，熒光檢測能夠?qū)崿F(xiàn)多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。熒光的其他好處在于動態(tài)范圍更寬、信號穩(wěn)定性更好。
為了讓這個轉(zhuǎn)換過程更加輕松，Bio-Rad的科學家為我們帶來了一些熒光western blot的小貼士。
• 抗體濃度應當優(yōu)化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比zui高的稀釋度。
• 從化學發(fā)光轉(zhuǎn)到熒光檢測時，一抗?jié)舛葢斣黾?；通常來說是增加2-5倍。二抗?jié)舛瓤赡芤残枰獌?yōu)化；1:5,000稀釋是個不錯的起點。在使用特定抗體時，可以參照生產(chǎn)商的建議。生物通 • 為了讓信噪比zui高，應使用自發(fā)熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence （LF） PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、zui多5%的脫脂奶粉，或zui多3% BSA，溶于TTBS中。• 緩沖液中的顆?？赡芡Ａ粼谀ど?，并造成熒光假象。只使用高質(zhì)量的試劑，并對所有緩沖液過濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會在熒光檢測時造成假象。生物通 • 使用鉛筆來標記膜，因為許多墨水都會發(fā)出熒光。
• 溴酚藍會發(fā)出熒光。確保染料與樣品已分開，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍。• 無需在暗處開展免疫檢測；正常的室內(nèi)燈光不會使熒光標記的抗體發(fā)生光漂白。不過，熒光標記抗體的儲液應保存在暗處。
• 在處理膜時，使用無粉末的手套，以避免膜上出現(xiàn)假象或指紋。
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