檢測人胰蛋白酶試劑盒實驗原理

                          檢測人胰蛋白酶試劑盒實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人胰蛋白酶（trypsin）水平。用純化的人胰蛋白酶（trypsin）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入胰蛋白酶（trypsin），再與HRP標記的胰蛋白酶（trypsin）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰蛋白酶（trypsin）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人胰蛋白酶（trypsin）濃度。

人胰蛋白酶試劑盒注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
人胰蛋白酶試劑盒操作步驟
        1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
16U/L 5號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液
8U/L 4號標準品 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液
4U/L 3號標準品 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液
2U/L 2號標準品 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液
1U/L 1號標準品 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液
        2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
       3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
       4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
       5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
       6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
       7. 溫育：操作同3。
       8. 洗滌：操作同5。
       9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
      10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
      11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
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