小鼠I型膠原C端肽(CTX-1)ELISA試劑盒

1.樣本類型和采集：

血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置0.5-2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

細胞裂解液: 吸棄培養液，用PBS（0.01 M，pH 7.4）將細胞洗一遍。用細胞刮刮下細胞，加入2-5 mL PBS（0.01 M，pH 7.4）。懸浮細胞可省略。收集細胞懸液，4℃ 1000×g離心10min，棄去培養基，用預冷的PBS潤洗3次。加入適量的預冷PBS或非變性細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞,通常6孔板一個孔的細胞量需要150-250μL PBS重懸。 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復凍融3次，使細胞充分裂解,也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。4℃ 10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2.樣本保存和穩定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，在- 20℃或-80℃可以儲存6個月及以上。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融。

步驟：

1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）。

2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

8. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

注意：

1. 試劑準備：試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用。準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2. 加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產生，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。與反應試劑加入一樣，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內），如果太大，將會導致不同的“預溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。為了測值的準確性，推薦設置復孔進行實驗。

3. 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4. 洗滌：濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔內殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應孔中吸水，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。如果使用自動洗板機，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5. 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化，如觀察到顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強而影響酶標儀光密度讀數。

6. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。